RNAi:新一代生物技术及其在植物保护中的应用

发布时间:2022-11-20 09:44 阅读次数:

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是真核生物中高度保守的基因沉默现象。基于RNA干扰技术的生物农药被认为是未来植保领域的颠覆性技术,将很大程度上改变人类防治农业病、虫、草等有害生物的思路和策略。本文给大家介绍RNA干扰技术的基本作用机制,在农业上的研发和商业化进展,探讨其在应用层面所面临的机遇、挑战及风险。分子生物技术总是存在或多或少的争议,新技术像把双刃剑,作为新农人,你又有怎样的见解。


神奇的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术

RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)介导的同源mRNA高效特异性降解的现象,也称为转录后基因沉默(PTGS),在植物、线虫、昆虫、脊椎动物等真核生物中普遍存在。该现象在上世纪90年代发现,并成为一种重要的基因干扰技术。

2001~2002年连续两年被《Science》杂志评为年度十大科学进展!该技术被认为是农业绿色防控中最具有应用潜力的生物技术之一。

1.1 小小知识点
在世间万物的生命活动中,各式各样的蛋白质承担重要作用。蛋白质的基本构成单位是氨基酸(20多种),而氨基酸则是根据对应的基因编码来排序,从而形成不同空间结构和不同功能的蛋白质。基因编码就是ATGC碱基对(腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G、胞嘧啶C)序列,存储在双螺旋DNA(脱氧核糖核酸)上。通常情况下,DNA的载体是染色体。从DNA到蛋白质,需要经历DNA复制、转录、蛋白质翻译和各种修饰。


DNA复制

复制就是从DNA制造相同DNA的过程。


DNA转录

转录是从DNA生成RNA(核糖核酸)的过程,即基因信息从DNA传递给RNA,也就是DNA上的ATGC编码变成了RNA上的AUGC(尿嘧啶U,替代DNA中的T)编码,这是基因表达最关键的一步,有很多类型的RNA,例如mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)等。


蛋白质翻译

翻译就是蛋白质的生物合成,主要参与者有核糖体、mRNA、各种氨酰tRNA、一种特殊的起始tRNA、起始因子、延伸因子和终止因子。整个过程包括氨基酸的活化、起始、延伸、终止和释放。


各种修饰

细胞内翻译好的产物还需经过后加工、定向和分拣等过程,才能成为有功能的最终蛋白质。这些修饰操作主要包括:多肽链的剪切、N端删除氨基酸、蛋白质的剪接、氨基酸的修饰、添加辅助因子、二硫键形成和寡聚化等。


1.2 RNAi的作用机制

与靶标基因对应的双链RNA(dsRNA)被核酸内切酶Dicer降解为多个小分子干扰RNA(siRNA),然后siRNA 与一种由多个分子组成的RNA诱导沉默复合体(RISC)结合,在ATP提供能量的情况下,siRNA中的反义链(asRNA)找到与其碱基互补的mRNA序列并由RIS中的Argonaute 蛋白质进行切割,使 mRNA 降解,并最终起到降低靶标基因表达的作用。简单一句话:就是双链RNA(dsRNA)诱导同源mRNA发生高效特异性降解,从而达到序列特异性转录后基因沉默的效果。


RNAi技术利用外源或内源dsRNA介导mRNA降解,可以特异性剔除或关闭靶标基因的表达,已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。与基因敲除、基因编辑等技术相比,RNAi极具优势。

2 RNAi技术在农业上应用方式

RNAi技术在农业上的应用方式,特别是在病虫害防治中的应用方式,可以通过三种方式来实现:
寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)


病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)


外源dsRNA诱导的基因沉默(Exogenous dsRNA-induced gene silencing,EdIGS)

HIGS通过转基因作物来表达针对害虫或病原物的dsRNA。

VIGS通过携带特定基因片段的重组病毒侵染宿主的过程来生产si/dsRNA

EdIGS更类似于传统农药的施用方法,通过非转基因手段,直接向环境中喷施或注射外源dsRNA,通过害虫取食或病原体侵染的过程而起作用。由于dsRNA分子很容易在环境中变性或被降解,EdIGS方法需要特殊的配方来提高有效成分的稳定性。如果可能的话,还可以通过合适的制剂手段提高RNAi的效率。与HIGS相比,EdIGS的施用窗口将成为防治成败的关键。

在农业领域,极具潜力的RNAi技术被寄予厚望,尤其是在病虫害防控领域,被称为农药史上的第三次革命。利用RNAi技术沉默有害生物生长发育过程中重要基因的表达,导致其生长发育障碍或者死亡,从而降低有害生物对农作物的侵害,实现病虫害防治,达到农作物安全生产的目的。此外,该技术也可以特异性下调有害生物对现有农药抗性基因的表达,从而延长现有农药的使用寿命,克服有害生物抗性问题。

利用RNAi技术进行病虫害防治具有防治目标专一性、靶标开发的便捷性、具有多种应用途径、使用无污染无残留、环境兼容性强等众多优势,完全符合公众对于绿色农药的需求。但不可否认的是,该技术目前仍然存在有待于克服的局限性以及生态环境风险性。


3 RNAi技术在农业上的应用进展

2014年,JR SimplotInnateÔ马铃薯在美国获准种植,随后在马来西亚、加拿大、墨西哥、日本、澳大利亚和新西兰等多个国家获批。该种马铃薯携带4RNAi基因,其中3个针对改善丙烯酰胺水平,第4个针对黑斑病毒控制基因。

2017年拜耳公司的第一款表达昆虫双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)的抗虫转基因玉米MON87411(SmartStax® PRO)获得美国环境保护署的种植许可。该玉米在2021年获得中国农业农村部转基因安全许可证书,预计2022年推广上市;同时,司多款基于喷洒的RNA生物农药已经提交或者准备提交EPA审核。

2018年,美国AgroSpheresTechAccel公司展开合作,共同研究RNA作为生物农药的输送方式。该研究利用了AgroSpheres独有的生物分子封装技术。

2019年,拜耳向美国EPA提交了新产品BioDirect,该产品是利用RNAi原理,通过dsRNA进行蜜蜂狄斯瓦螨防治,这是向EPA提交的第一份外源应用的 RNAi生物农药活性成分。20215月,拜将该部分专利授权给Greenlight Biosciences进行dsRNA的生产,新产品预计2024年上市。

2019年生物工程公司Renaissance BioScience向美国专利商标局(PTO)提交了采用酵母技术生产和输送RNA生物活性成分的专利申请。

202129日,澳新食品标准局(FSANZ)批准基于RNAi 的耐除草剂和抗虫玉米产品DP23211用于食品,该转基因玉米同时表达了dsDvSSJ1IPD072Aa蛋白用于防治玉米根虫。

2022年美国GreenLight BiosciencesEPA提交注册一种用于防控马铃薯甲虫的dsRNA产品。该公司的GreenWorX技术是其独有的无细胞生物程序,借此可较快生产出成本效益好的高品质RNA产品,从而克服了此类产品生产成本高,生产耗时长,且产品品质难以保障的诸多问题。同时,该公司也在积极研发针对白粉病以及灰霉病的RNAi 产品,预计2025年能够作为第一款杀菌剂进行批准上市。

此外RNAissance Ag LLC在积极开发针对小菜蛾的喷雾式RNA生物农药。先正达公司在进行马铃薯甲虫RNAi杀虫剂的研制,并且预计在7-10年实现商业化。

中国科学院苗雪霞团队在多物种靶标RNAi基因库构建、制剂配方优化、规模化生产体系、以及安全性评估等领域进行了大量的研究。

中国科学院郭惠珊团队长期致力于应用RNAi技术进行棉花抗黄萎病的研究工作,2019年,该团队与新疆华晨合丰投资有限公司达成战略合作协议,该公司将在最短时间内资助课题组改善中试、生产性试验以及品种审定等环节,加速成果转化和产业化速度。

中国农业科学院王桂荣团队针对棉花害虫绿盲蝽构建了植物介导的RNAi转基因玉米与大豆系统。

中国农业大学沈杰团队通过纳米包被技术显著提高了dsRNA的稳定性,进而提高昆虫RNAi效率。


4 RNAi技术的挑战与风险
4.1 RNAi技术的挑战
如何选择dsRNA运载体系使其能够高效特异的进入细胞:除了dsRNA在环境中的稳定性问题外,如何将其高效传递给靶标有害生物也是一个重要挑战。

如何筛选针对防治对象(如病原体、昆虫、杂草等)靶标基因的dsRNA序列:某些害虫对RNAi没有特别的反应。例如毛毛虫以及蚜虫、叶蝉、粉虱和它们的近亲都相当顽固。

如何保障外源dsRNA使用过程中的生物安全:dsRNA对非靶标生物通常是安全的,但有些基因在不同物种之间相似甚至相同。因此,意外靶向这些物种的基因可能会产生意想不到的后果。

4.2 RNAi技术的风险

dsRNA可能同样存在抗性问题。将会出现能够以某种方式破坏或避免dsRNA分子的突变体,这些突变体将生存、繁殖。一旦某种类型的dsRNA对靶标害虫失败,其余的也会失败。对于杂草也有同样的抗性和意外靶向质疑:理论上专一的靶向性是否会有漏洞?非靶向基因会不会意外躺枪而产生意想不到的后果?魔高一尺道高一丈的抗性或许依然会应运而生?并非所有杂草都需消灭,有许多杂草是维系生态平衡所不可或缺的;一旦RNAi蔓延造成基因污染,可能带来生态灾难。


纵观科技发展历史,任何一项新技术的应用都有其双面性,技术更新都是新技术克服老技术带来的问题,不断迭代进行!植物保护经历了化学农药、生物农药、蛋白质农药,基于RNAi技术的dsRNA农药是否会大放异彩?评论区留下您的观点吧!


文献参考:

【1】GOODFELLOW S,ZHANG D A,WANG M B,et al. Bacterium-mediated RNA interference:potential application in plant protection

【2】BRAMLETT M,PLAETINCK G,MAIENFISCH P. RNA-based biocontrols:A new paradigm in crop protection

【3】CHOUDHURY A,RAJAM M. RNA Interference and artificial micro-RNA technology as new tools for engineering insect resistance in crop plants

【4】KARKARE S,DANIEL S,BHATNAGAR D. RNA interference silencing the transcriptional message: aspects and applications

【5】 MEZZETTI B, SMAGGHE G,ARPAIA S, et al. RNAi: What is its position in agriculture?

【6】基于RNA干扰的生物农药的发展现状与展望

【7】RNAi技术防控害虫研究进展

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